Profil genetyczny

Profil genetyczny, czasami nazywany profilem DNA, to zestaw markerów genetycznych umożliwiających jednoznaczną identyfikację osobnika. Marker genetyczny jest specyficznym fragmentem kodu genetycznego DNA, który różni się między poszczególnymi osobnikami. Profil genetyczny pozostaje niezmienny przez całe życie i nie może zostać sfałszowany ani zniszczony. Jest wykorzystywany do identyfikacji osobników, potwierdzania pochodzenia, określania pokrewieństwa oraz optymalizacji hodowli.

Zastosowanie profilu genetycznego

Ustalenie profilu genetycznego stanowi niezawodną identyfikację przez całe życie w wielu sytuacjach:

• W przypadku zaginięcia lub kradzieży konia – umożliwia potwierdzenie tożsamości odnalezionego zagubionego lub skradzionego konia.
• W przypadku awarii mikroczipu – jeśli mikroczip konia przestanie działać, profil genetyczny pozwala potwierdzić jego tożsamość i przeprowadzić ponowne oznakowanie mikroczipem.
• Przy sztucznej inseminacji – służy do identyfikacji nasienia.

Profil genetyczny jest również wykorzystywany do weryfikacji pochodzenia:

• Do rutynowej kontroli rodowodów lub w przypadku wątpliwości dotyczących pochodzenia – umożliwia wiarygodne potwierdzenie ojcostwa lub macierzyństwa po planowanym kryciu, przypadkowym pokryciu lub inseminacji.
• W celu potwierdzenia statusu „clear by parentage” (wolny na podstawie pochodzenia) – jeśli oboje rodzice zostali przebadani pod kątem recesywnej choroby genetycznej monitorowanej w danej rasie i uzyskali wynik negatywny, a pochodzenie zostało potwierdzone profilem genetycznym, potomstwo może zostać oznaczone jako „clear by parentage”. Zaleca się stosowanie tego podejścia jedynie co drugie pokolenie.
• Weryfikacja innych relacji rodzinnych – jeśli nie można zbadać rodziców, możliwe jest potwierdzenie innych stopni pokrewieństwa, takich jak rodzeństwo, dziadek–wnuk czy wujek/ciotka–siostrzeniec/bratanek. Im więcej spokrewnionych osobników zostanie uwzględnionych w analizie, tym dokładniejszy będzie wynik i oszacowanie prawdopodobieństwa pokrewieństwa.

W hodowli profil genetyczny służy jako narzędzie do:

• Doboru optymalnych par hodowlanych – porównanie profili genetycznych umożliwia wybór odpowiednich kombinacji osobników w celu zachowania różnorodności genetycznej i ograniczenia chowu wsobnego w populacji.
• Badań populacyjnych – monitorowania różnorodności genetycznej, heterozygotyczności i stopnia inbredu.

Pobieranie próbek

Do badań profilu genetycznego preferowane są próbki krwi. Pobrania dokonuje lekarz weterynarii, który jednocześnie potwierdza tożsamość zwierzęcia poprzez odczyt mikroczipu. Analiza jest bardzo wrażliwa na jakość DNA. Możliwe jest również wykorzystanie wymazu z błony śluzowej policzka, jednak próbka musi być pobrana prawidłowo i przechowywana w przepuszczającym powietrze opakowaniu, aby mogła dokładnie wyschnąć.

Metodyka badania

Laboratorium Genomia stosuje międzynarodowo uznawany standard ISAG (International Society for Animal Genetics), wykorzystywany do identyfikacji genetycznej i potwierdzania pochodzenia zwierząt gospodarskich i towarzyszących, w tym koni. Genomia regularnie osiąga najwyższe wyniki w testach jakości organizowanych przez ISAG. Oznaczanie profili DNA jest akredytowane przez Czeski Instytut Akredytacji zgodnie z normą ISO 17025, co potwierdza najwyższe kompetencje laboratorium w zakresie profilowania DNA koni.

Do tworzenia profilu genetycznego stosuje się dwie główne technologie: STR i SNP. Metody te nie są wzajemnie kompatybilne, a ich wyników nie można bezpośrednio porównywać.

Profil genetyczny SNP

Profil genetyczny SNP (Single Nucleotide Polymorphism) opiera się na analizie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów, czyli zmian w sekwencji DNA na poziomie pojedynczych nukleotydów. Zmiany te są bardzo stabilne i dziedziczone zgodnie z prawami Mendla, co zapewnia wysoką wiarygodność oraz bardziej precyzyjną i solidną identyfikację genetyczną.

Profile SNP doskonale nadają się do badań populacyjnych, ponieważ obejmują dużą liczbę markerów równomiernie rozmieszczonych na wszystkich chromosomach. Zapewnia to pełne pokrycie genomu oraz reprezentatywną ocenę heterozygotyczności i różnorodności genetycznej. Profilowanie SNP wykorzystuje nowoczesne technologie sekwencjonowania równoległego na dużą skalę, zwiększając niezawodność i efektywność badań.

Etapy analizy SNP

Izolacja DNA

Szczególny nacisk kładzie się na wysoką jakość próbki, przy czym krew jest materiałem najbardziej odpowiednim do analizy.

Masowo równoległe sekwencjonowanie (MPS)

Do analizy SNP wykorzystuje się nowoczesną metodę masowo równoległego sekwencjonowania, zwaną również sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS), która umożliwia jednoczesny odczyt setek lub tysięcy wariantów genetycznych.

Identyfikacja markerów SNP

Każdy marker SNP reprezentuje określoną pozycję w DNA, w której występuje zmienność pojedynczego nukleotydu. Panele ISAG2020 1 i 2 standaryzują analizę 859 markerów SNP, umożliwiając międzynarodowe porównywanie wyników. Genomia gwarantuje raportowanie co najmniej 95% markerów.

Analiza bioinformatyczna

Po sekwencjonowaniu dane są analizowane za pomocą specjalistycznego oprogramowania bioinformatycznego, które określa genotyp osobnika na podstawie obecności konkretnych wariantów SNP. Każdy marker SNP jest przedstawiany jako dwie zasady nukleotydowe („dwie litery”), z których jedna została odziedziczona od każdego z rodziców.

Zalety profilowania SNP

• Wyższa dokładność – analiza większej liczby markerów rozmieszczonych na wszystkich chromosomach pozwala na dokładniejszą identyfikację osobników i ocenę pokrewieństwa.
• Większa stabilność markerów – średnio jedna mutacja występuje na każde 100 milionów zasad w jednym pokoleniu. Dla porównania, w przypadku markerów STR mutacja pojawia się średnio raz na 1 000–10 000 transmisji danego markera.
• Wyższa wydajność technologii – umożliwia analizę setek próbek jednocześnie.
• Lepsza przydatność do badań populacyjnych – pozwala monitorować inbred, różnorodność genetyczną oraz poziom homozygotyczności i heterozygotyczności. Genomia raportuje wartość heterozygotyczności dla każdego profilu SNP.

Wadami tej metody są dłuższy czas opracowania próbek oraz wyższe koszty analizy i wymaganej infrastruktury technologicznej (wydajne komputery, specjalistyczne oprogramowanie bioinformatyczne, duże zasoby pamięci masowej oraz walidacja urządzeń MPS). Z drugiej strony, dzięki wysokiej przepustowości technologii, koszt analizy przypadający na próbkę maleje wraz ze wzrostem liczby badanych próbek.

Profil genetyczny STR (ISAG2006)

Profil genetyczny STR (Short Tandem Repeats) opiera się na analizie markerów mikrosatelitarnych – krótkich, powtarzających się sekwencji DNA składających się z dwóch do siedmiu par zasad. Liczba powtórzeń jest indywidualna dla każdego osobnika i dziedziczona po rodzicach, dzięki czemu profile STR stanowią doskonałe narzędzie do potwierdzania pochodzenia i identyfikacji genetycznej.

Etapy analizy STR

Izolacja DNA

Z próbki izolowane jest DNA, które stanowi materiał wyjściowy do analizy.

Amplifikacja metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Specyficzne fragmenty DNA zawierające markery STR są namnażane za pomocą PCR. Każdy marker STR jest amplifikowany przy użyciu starterów (primerów) – krótkich sekwencji DNA. Jeden z primerów jest oznaczony na końcu 5’ barwnikiem fluorescencyjnym, co umożliwia detekcję produktu.

Rozdział fragmentów metodą elektroforezy

Namnożone fragmenty DNA są wprowadzane do aparatu do elektroforezy kapilarnej, gdzie są rozdzielane według długości w polu elektrycznym. Każdy allel markera STR odpowiada określonej długości fragmentu zależnej od liczby powtórzeń sekwencji.

Detekcja i analiza danych

Fragmenty DNA oznaczone fluorescencyjnie są wykrywane za pomocą skanera laserowego. Wynikiem jest elektroferogram przedstawiający długość każdego markera STR.

Interpretacja wyników

Wynikiem analizy jest unikalna kombinacja markerów identyfikująca osobnika. Dla każdego markera jeden allel jest dziedziczony od ojca, a drugi od matki. Porównanie profili STR umożliwia potwierdzenie tożsamości oraz relacji pokrewieństwa z wiarygodnością przekraczającą 99,99%.

.