Profil genetyczny

Profil genetyczny, czasami określany jako profil DNA, to zestaw markerów genetycznych, które umożliwiają jednoznaczną identyfikację osobnika. Marker genetyczny to specyficzna część kodu genetycznego DNA, która różni się u poszczególnych osobników. Profil genetyczny pozostaje niezmieniony przez całe życie i nie może być sfałszowany ani zniszczony. Służy do identyfikacji osobnika, weryfikacji pochodzenia i pokrewieństwa lub optymalizacji hodowli.

Możliwości wykorzystania profilu genetycznego

Profilowanie genetyczne służy w wielu przypadkach jako wiarygodna identyfikacja przez całe życie :

• W przypadku zagubienia lub kradzieży psa — umożliwia udowodnienie tożsamości osobnika w przypadku znalezienia zagubionego lub skradzionego psa.
• W przypadku nieprawidłowego działania mikroczipa — W przypadku, gdy mikroczip noszony przez psa przestaje działać, możliwe jest udowodnienie tożsamości psa i wykonanie nowego zaczipowania.
• W inseminacji — służy do identyfikacji nasienia.

Służy do weryfikacji pochodzenia:

• Do rutynowych kontroli rodowodów lub problemów związanych z pochodzeniem – Służy do wiarygodnej weryfikacji ojcostwa lub pochodzenia ze strony matki po celowym kryciu, przypadkowym kryciu lub inseminacji.
• Podwójnego krycia/Double matingu – W przypadku niektórych ras psów możliwe jest ubieganie się o zgodę na podwójne krycie, w takim przypadku konieczne jest, aby matka, wszystkie szczenięta i obaj ojcowie mieli ustalone profile DNA, a ojcostwo zostało ustalone u szczeniąt.
• W przypadku weryfikacji "clear po rodzicach" – Jeśli oboje rodzice są badani pod kątem recesywnej wady genetycznej monitorowanej u danej rasy z wynikiem negatywnym, tj. oboje są zdrowi, możliwe jest oznaczenie ich potomstwa jako "czyste po rodzicach" przy udowadnianiu pochodzenia na podstawie profilu genetycznego. Zaleca się stosowanie tylko co drugie pokolenie.
• Jeśli nie ma możliwości zweryfikowania rodziców, można zweryfikować inne powiązania rodzinne – rodzeństwo, wnuk/dziadek, siostrzeniec/wujek... Im więcej krewnych zostanie uwzględnionych w teście, tym dokładniejszy będzie uzyskany wynik (tym dokładniejsze prawdopodobieństwo pokrewieństwa)

W hodowli służy jako narzędzie do:

• Wyboru optymalnej pary hodowlanej — Porównując profile genetyczne, można wybrać najbardziej odpowiednie kombinacje osobników, aby zachować różnorodność genetyczną w obrębie rasy. Pożądane jest, aby para hodowlana była jak najbardziej heterozygotyczna (różna) pod względem porównywanych cech.
• Badań populacyjnych — monitorowania różnorodności, heterozygotyczności, chowu wsobnego

Pobieranie próbek

W przypadku badania profilu genetycznego preferujemy próbki krwi. Pobranie jest wykonywane przez lekarza weterynarii i jednocześnie potwierdza tożsamość osobnika poprzez odczyt mikroczipa. Analiza jest bardzo wrażliwa na jakość DNA. Można użyć  róbki wymazu z błony śluzowej policzka, ale musi ona być bardzo dobrze zebrana i przechowywana w oddychającym opakowaniu, aby dobrze wyschła.

Metodologia określania

Laboratorium Genomia korzysta z uznanego na całym świecie i rekomendowanego przez FCI standardu ISAG (International Society for Animal Genetics). W testach jakości ISAG wielokrotnie osiąga najwyższą ocenę jakości. Określanie profilu DNA jest akredytowane przez Czeski Instytut Akredytacyjny zgodnie z normą ISO 17025, dzięki czemu Genomia posiada najwyższe możliwe kompetencje w zakresie określania profili DNA psów.

Istnieją dwa główne podejścia technologiczne do określania profilu genetycznego: STR i SNP. Podejścia te nie są ze sobą kompatybilne i nie można ich porównywać.

Profil genetyczny SNP (ISAG2020)

Profil genetyczny SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) skupia się na analizie polimorfizmów punktowych, czyli zmian w sekwencji DNA na poziomie pojedynczych nukleotydów. Zmiany te są bardzo stabilne i są dziedziczone zgodnie z prawami endla, co zapewnia wysoką niezawodność oraz dokładniejszą i solidniejszą identyfikację genetyczną. Profile SNP mogą być dobrze wykorzystywane w badaniach populacyjnych, ponieważ zawierają dużą liczbę markerów równomiernie rozmieszczonych na wszystkich chromosomach. Zapewnia to pełne pokrycie i reprezentacyjne przedstawicielstwo do oceny heterozygotyczności i różnorodności. Profilowanie SNP wykorzystuje nowoczesne technologie sekwencjonowania do masowo równoległego sekwencjonowania, co zwiększa niezawodność i efektywność testowania.

Analiza SNP odbywa się w kilku krokach:

• Izolacja DNA — Nacisk kładziony jest na wysoką jakość próbki – najodpowiedniejszym materiałem jest krew.
• Masowe równoległe sekwencjonowanie (MPS) — Nowoczesna metoda masowego równoległego sekwencjonowania lub sekwencjonowania nowej generacji (NGS) jest używana do analizy SNP, co pozwala na jednoczesne odczytywanie setek do tysięcy wariantów genetycznych.
• Identyfikacja markerów SNP — Każdy marker SNP reprezentuje określoną pozycję w DNA, w której występuje zmienność pojedynczego nukleotydu. Panele 1 i 2 ISAG2020 standaryzują analizę 231 markerów SNP, umożliwiając międzynarodowe porównania wyników. Genomia zgłasza co najmniej 218 markerów.
• Analiza bioinformatyczna — Po sekwencjonowaniu dane są przetwarzane przez oprogramowanie bioinformatyczne, które określa genotyp osobnika na podstawie obecności określonych wariantów SNP. Każdy marker SNP niesie ze sobą "dwie litery" (dwie zasady nukleotydowe), z których każda została odziedziczona przez osobnika od innego rodzica.

Podsumowanie zalet profilowania SNP:

• Większa dokładność – śledzenie większej liczby markerów równomiernie rozmieszczonych na wszystkich chromosomach pozwala na dokładniejszą identyfikację osobników i relacji rodzinnych.
• Wyższa stabilność markerów – jedna mutacja występuje średnio na każde 100 milionów podstaw na pokolenie (dla porównania, marker STR ma mutację średnio na każde 1 000–10 000 transmisji danego markera)
• Wyższa wydajność metody technologicznej — analiza setek próbek jednocześnie
• Odpowiedniejsze do badań populacyjnych — monitorowanie chowu wsobnego, różnorodności genetycznej, homozygotyczności/heterozygotyczności. Genomia podaje wartość heterozygotyczności dla każdego profilu SNP.

Wadą jest dłuższy czas przetwarzania próbek oraz wyższe koszty analizy i niezbędnych technologii (wydajne komputery, specjalistyczne oprogramowanie do oceny wyników, duże magazyny danych, walidacja sekwencera MPS). Z drugiej strony, ze względu na dużą wydajność technologii, cena analizy spada wraz z liczbą badanych próbek.

Profil genetyczny STR (ISAG2006)

Profil genetyczny STR (Short Tandem Repeats) opiera się na analizie markerów mikrosatelitarnych – krótkich powtarzających się sekwencji DNA o wielkości od dwóch do siedmiu par bazowych. Liczba tych powtórzeń jest indywidualna i dziedziczona po rodzicach, co sprawia, że profile STR są doskonałym narzędziem do weryfikacji pochodzenia i identyfikacji genetycznej.

Proces analizy STR składa się z kilku głównych etapów:

• Izolacja DNA — DNA jest ekstrahowane z próbki, która służy jako materiał wyjściowy do analizy.
• Amplifikacja w drodze reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) — Określone odcinki DNA zawierające markery STR są namnażane przez PCR. Każdy marker STR jest celowo amplifikowany za pomocą starterów – krótkich sekwencji DNA, przy czym jeden ze starterów jest na końcu 5' znakowany barwnikiem fluorescencyjnym, co pozwala na wykrycie produktu
• Separacja fragmentów za pomocą elektroforezy - Namnożone fragmenty DNA są wprowadzane do kapilarnego urządzenia elektroforetycznego, gdzie są rozdzielane według długości w polu elektrycznym. Każdy allel markera STR odpowiada określonej długości fragmentu, który zależy od liczby powtórzeń sekwencyjnego motywu.
• Wykrywanie i analiza danych — Fluorescencyjnie znakowane fragmenty DNA są wykrywane przez skaner laserowy. Rezultatem jest zapis elektroforetyczny, który pokazuje długość każdego markera STR.
• Interpretacja wyników — Wynikiem jest unikalna kombinacja markerów, która identyfikuje osobnika. W każdym markerze osobnik dziedziczy jedną wartość po ojcu i jedną po matce. Porównując profile STR, możliwe jest zweryfikowanie tożsamości osobnika lub potwierdzenie powiązań rodzinnych z ponad 99,99% wiarygodnością.
• Lista markerów zawartych w panelu ISAG2006: AHTk211, CXX279, REN169O18, INU055, REN54P11, INRA21, AHT137, REN169D01, AHTh260, AHTk253, INU005, INU030, Amelogenina, FH2848, AHT121, REN162C04, AHTh171, REN247M23, AHTH130, REN105L03, REN64E19. Genomia zgłasza co najmniej 19 markerów.