Genetika zvířat: dnes již snadno a rychle dostupná v ČR

Genetika zvířat: dnes již snadno a rychle dostupná v ČR

Kde všude se genetický test může uplatnit

Genetické testování zvířat se v posledních letech stalo běžnou praxí v chovatelství i veterinářství. Genetika má řadu možností uplatnění od identifikace přenašečů dědičných nemocí, přes průkaz dědičné nemoci, přímé detekce a kvantifikace patogenních organismů, přes farmakogenetiku až ke genové expresi nádorových buněk. Díky novým technologiím došlo k významnému urychlení a zlevnění genetického testování. Česká laboratoř Genomia, akreditována ČIA dle normy ČSN EN ISO/IEC 17025:2005 pod číslem 1549, provádí přes 120 různých genetických testů pro psy, kočky, ptáky, koně, ale i exotická zvířata jako hyeny, bodlíny, ježury, medvědy a jiná.

Nejběžnější z genetických testů jsou testy prokazující přítomnost mutace způsobující dědičnou chorobu. Dědičné choroby mohou být autozomálně recesivní nebo dominantní nebo vázané na pohlaví.

Recesivně dědičné nemoci jsou ty, které se klinicky projeví u jedinců, jež zdědili mutovaný gen od obou svých rodičů. Hrozba recesivních onemocnění spočívá ve spojení dvou přenašečů mutace – přenašeči jsou klinicky bez příznaků, ale nesou jednu kopii mutovaného genu. Ze spojení dvou přenašečů vzejde statisticky 75 % klinicky zdravých jedinců (50 % přenašečů mutace a 25 % jedinců bez mutace) a 25 % nemocných psů s dvěma kopiemi mutovaného genu.

Dominantně dědičné nemoci jsou takové, kdy k projevu nemoci stačí jedna kopie mutovaného genu zděděná od jednoho rodiče. Pohlavně vázané nemoci způsobují mutace umístěné na pohlavních chromozomech.

Nástroje genetiky lze velmi úspěšně využít k přímému prokázání patogenu ve vzorku, kdy se detekuje specifická genová sekvence patogenu. Některé metodiky umožňují také množství patogenu ve vzorku kvantifikovat. Obecně tento přístup zjišťuje, jestli je v danou chvíli ve vzorku patogen přítomný. Metodika neinterferuje s vakcinací ani s dříve prodělanými nákazami na rozdíl od imunologických metod.

V humánní genetice je již běžné používat genetiku pro individualizovanou léčbu. Například lze zjistit, jaké geny jsou aktivní v nádorových tkáních a na základě toho cílit léčbu. Ve veterinární medicíně jsou takové postupy samozřejmě také možné, ale vzhledem k ceně analýzy to zatím nepatří to běžné praxe. Laboratoř Genomia se zabývá stanovením mutací ve vybraných exonech c-kit genu ve vzorcích biopsií kožních mastocytomů.

Jaký je princip genetických testů

Obecně je v první části analýzy provedena izolace nukleových kyselin (DNA nebo RNA) z biologického vzorku. V této fázi je třeba rozbít buněčné struktury a uvolnit obsah jádra. Použitím různých postupů se pak vzorek proplachuje a filtruje, aby byl očištěn a zbyla čistá nukleová kyselina. Vzorek DNA či RNA vypadá jako malé množství čiré kapaliny.

Prakticky všechny detekční metody dále využívají polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a případně její modifikace. Metoda je založena na velmi snadné a rychlé amplifikaci (zmnožení) požadovaného úseku DNA (části vyšetřovaného genu). Cílový úsek DNA je ohraničen pomocí primerů (krátkých oligonukleotidů), které se specificky váží k DNA v okolí místa zájmu (např. kauzální mutace způsobující dědičné onemocnění). K syntéze nového vlákna DNA se používá enzym DNA polymeráza. Typická cyklická reakce má tři fáze, každá trvá obvykle kolem 30 s:

1) Denaturace – DNA se zahřívá nad 92 °C, tím dochází k rozrušení vodíkových můstků v dvoušroubovici DNA a vzniká tak jednovláknová DNA.

2) Annealing – v této fázi na jednovláknovou DNA naváží primery, které specificky ohraničí oblast genu v místě našeho zájmu. Teplota annealingu se pohybuje mezi 50-65 °C. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza.

3) Syntéza DNA – teplota vhodná pro syntézu DNA je kolem 72 °C, protože při této teplotě je aktivní enzym DNA polymeráza. V této fázi vznikají nová vlákna DNA, tzv. PCR produkty.

Kroky 1-3 se cyklicky opakují 30-40x. Dojde při nich k exponenciálnímu nárůstu počtu kopií PCR produktu, úseku DNA ohraničeném dvěma primery. Výsledkem reakce je několik milionů kopií určitého úseku DNA.

PCR produkt je podroben následné post-PCR analýze, např. detekci na agarózovém gelu, přímé sekvenaci, restrikčnímu štěpení atd. Vyhodnocením post-PCR analýzy získáme informace o přítomnosti či nepřítomnosti hledaného znaku (např. kauzální mutace) nebo kvantitativní či kvalitativní informaci o testovaném patogenu.

Snadný způsob odběru vzorků

Běžně přijímanými vzorky pro genetický rozbor jsou stěry bukální sliznice, vzorky krve, peří, tkání, popř. jiné specifické vzorky pro průkaz patogenů. V případě dobře provedeného odběru je získané množství DNA z jednoho vzorku biologického materiálu dostačující pro provedení více genetických testů.

Stěry bukální sliznice je možné provést pomocí sterilních kartáčků určených k provedení cytologických stěrů. Kartáčkem se důkladně setře vnitřní strana tváře zvířete, je podstatné, aby všechny strany kartáčku byly v kontaktu s tváří. Kartáček se nechá na vzduchu oschnout a vloží se do obálky.  Z důvodu znehodnocení biologického materiálu nesmí být kartáček neprodyšně uzavřen.

Krevní vzorek je nutné odebrat do zkumavky  s látkou zamezující krevnímu srážení (EDTA - K2 nebo K3); dostačující množství je 0,5-1ml.

Použití genetiky pro identifikaci jedinců

Stanovení pohlaví u zvířat

Existuje řada zvířecích druhů, které nevykazují výrazný pohlavní dimorfismus. V těchto případech je možné využít genetiku k detekci pohlavních chromozomů.

Například určení pohlaví mláďat ptáků podle morfologických znaků je téměř u většiny druhů naprosto nemožné. Dospělci celé poloviny druhů ptáků nevykazují morfologické rozdíly mezi samcem a samicí buď vůbec, nebo jen na úrovni, podle které nemůže být pohlaví spolehlivě určeno. Pohlaví ptáků je určeno pohlavními chromozomy Z a W. Samice jsou heterogametické (na rozdíl od člověka) a jejich chromozomová sada obsahuje kombinaci pohlavních chromozomů ZW. Samci jsou homogametičtí, jejich chromozomová sada obsahuje chromozomy ZZ.  Na základě prokázání přítomnosti či absence specifické sekvence W chromozomu lze určit pohlaví ptačího jedince.

Určit pohlaví může být problém také u některých savců. Genomia stanovuje pohlaví například u hyen, ježur, medvědů nebo bodlínů. Pro stanovení pohlaví savců se využívá zejména detekce specifických genů např. amelogenin, ZFX a ZFY nebo detekce samčího genu SRY, který je zodpovědný za spuštění vývoje samčího pohlaví.

Identifikace jedince s využitím DNA profilu

Dna profil (genetický profil) je sada hodnot určitých markerů, které jsou pro jedince specifické a umožňují jeho jednoznačnou identifikaci. Vzájemným srovnáním DNA profilů jedinců je možné ověřit příbuznost jedinců, například prokázat otcovství.  V současné době se rutinně využívá stanovení genetického profilu a následného ověření rodičovství u zvířat narozených po inseminaci. U ptáků se genetický profil stanovuje pro ověření příbuznosti a kontrolu umělých odchovů, že nedochází k odchytu chráněných druhů v přírodě. Poslední světové trendy v chovech psů a koček směřují k plošnému DNA profilování chovných jedinců a vytváření databází, které umožní jednoznačnou kontrolu chovů.

Díky vysoké hladině polymorfizmu (informativity) a Mendelovské dědičnosti se vhodnými genetickými markery pro studium druhové diverzity, testování paternity a vlastní identifikace staly krátké tandemové repetitivní sekvence (STR – short tandem repeats). Tyto sekvence, také nazývané mikrosatelity, jsou třídou genetických markerů, sestávajících se z tandemově opakovaných sekvencí o velikosti dvou až sedmi párů bází. Alely STR lokusu se odlišují podle počtu opakování daného sekvenčního motivu. Můžete si je představit jako opakování krátkého motivu kódu DNA mnohokrát těsně za sebou např. dinukleotidový motiv GT opakující se mnohokrát za sebou GTGTGTGT… Jedinci se vzájemně odlišují v počtu opakování tohoto motivu, a právě to se stalo základem pro jednoznačnou identifikaci. Kromě pohlavních chromozómů (X a Y) se všechny ostatní chromozomy nacházejí v buňkách v páru, jedinec vždy zdědí jeden od matky a druhý od otce, tj. i každá repetitivní sekvence je děděna jedna od matky a jedna otce.

STR alely jsou nejčastěji zjišťovány pomocí multiplexové PCR, kde výsledné produkty jsou fluorescenčně značené, což umožňuje jejich separaci a vizualizaci s použitím automatizovaného elektroforetického přístroje.

Aby byly výsledky stanovení DNA profilů přenositelné mezi laboratořemi, byl zaveden mezinárodní společností pro zvířecí genetiku ISAG (International Society of Animal Genetics) jednotný standard pro řadu hospodářských zvířat a také pro psy a kočky.

Laboratoř Genomia stanovuje DNA profil psů dle ISAG standardu, který zahrnuje stanovení 22 markerů. Genomia také provádí genetickou identifikaci ptáků, konkrétně jestřábů lesních, a exotů rodů Ara a Amazoňan.