Testování psů: PCR vyšetrení mutací c-kit

země EU
země mimo EU
Česká republika
Jste registrován jako plátce DPH v zemi EU jiné než v České republice?
CZK EUR USD
Obvyklá doba vyšetření: 21 pracovních dnů
Cena za 1 test: 158.00 $ bez DPH

PCR vyšetření mutací c-kit

Mezi nejčastější novotvary ve veterinární medicíně patří nádory žírných buněk, mastocytů, jejichž výskyt je u psů a koček mnohem vyšší než u lidí. Průběh onemocnění může být od benigního lokálního tumoru až po agresivní typ s časnými metastázami do lymfatických uzlin nebo orgánů. Maligní léze jsou častější u psů než u koček. U psů koreluje průběh choroby s histologickým gradingem nádoru, málo diferencované mastocytomy (grade III) rostou často velmi rychle a mají tendenci k metastázování.

Pro určení prognózy je velmi podstatná lokalizace nádoru a následné histopatologické vyšetření, které zahrnuje zjištění typingu, gradingu a stagingu nádoru. Klasické histopatologické vyšetření je vhodné doplnit o imunohistologické vyšetření, které stanoví buněčné proliferační markery (jako např. Ki67), a molekulárně-genetické vyšetření, které zjistí typ exprese KIT. Byly nalezeny tři různé varianty exprese KIT: cytoplazmatický difuzní typ, membránový typ a cytoplazmatický perinukleární typ. Poslední zmíněný typ koreluje s přítomností somatických mutací a nese některé relevantní prognostické informace.

Na základě určení typingu, gradingu a stagingu nádoru bývá navržena léčba spočívající v chirurgické operaci anebo různé kombinaci chirurgie, radioterapie a chemoterapie (např. vinblastin, lomustin, prednison). Bohužel, v mnoha případech je chování nádorů obtížně předvídatelné a stanovení prognózy náročné. Konsensuální panel veterinárních onkologů doporučil vyhodnocení somatických mutací c-kit jako běžnou součást diagnostiky a určení prognózy mastocytomů u psů (Joint Meeting of ESVONC a VCS, Kodaň 2008).

c-kit a jeho význam

C-kit je gen, který kóduje protein KIT, tj. transmembránový tyrozinkinázový receptor pro ligand růstový faktor SCF (stem cell factor). C-kit je zároveň protoonkogen, který má i svůj virový protějšek v-kit (virus sarkomu koček FeSV-4). Poruchy signalizace zprostředkované mutacemi c-kit byly popsány v řadě patologický stavů, zejména u některých nádorů, ale i u alergií a piebaldismu (parciální albinismus). Zásadně důležité je, že mutovaný? KIT receptor je možno farmakologicky blokovat specifickými inhibitory (např. imatinib mesylát, masitinibum, toceranib phosphate).

KIT hraje významnou roli ve vývoji mastocytů, melanocytů, kmenových buněk bílé i červené krevní řady, zárodečných buněk a Cajalových buněk v gastrointestinálním traktu. Po vazbě ligandu aktivuje intracelulární kinázová doména signální dráhu, která je stěžejní pro růst a diferenciaci žírných buněk. Receptor je tvořen extracelulární doménou (kódovanou exony 2 až 9), transmembránovou doménu (kódovanou exonem 10), intracelulární juxtamembránovou doménou (kódovanou exonen 11) a dvěma intracelulárními kinázovými doménami (kódovanými exony 11 až 20). Každá doména KIT má odlišnou funkci. Bylo popsáno, že somatické mutace v psím c-kit u exonů 8, 9, 11, 12 a 17 vedou k aktivování kinázy nezávisle na ligandu.

V exonech c-kit psích mastocytů byly nalezeny tandemové duplikace (tzv. internal tandem duplications, ITD), indel mutace, inzerce, delece, a jednonukleotidové substituce. Nejprve byly popsány tandemové duplikace v exonu 11, které se jevily jako nejčastější. Toto zjištění bylo dále potvrzeno studií, která nenalezla žádnou mutaci u exonů 16 až 20. Je již potvrzeno, že ITD v exonu 11 skutečně představují nejčastější mutace c-kit a tvoří přibližně 65 % všech mutací.

Dále byly nalezeny také relativně časté mutace exonů 8 a 9. Mutace v exonu 8 se vyskytují u 5 % mastocytomů a jedná se o ITD a jednobodové substituce. V exonu 9 se mohou nalézat dvě různé jednobodové substituce a to přibližně u 4 % případů. Indel mutace, inzerce a delece v exonu 11 se vyskytují asi u 17 % mastocytomů.

Jedna indel mutace vzniká v sestřihovém místě mezi exonem 17 a intronem 17-18. Tato mutace byla objevena analýzou cDNA, kdy v transkriptu zcela chyběl produkt exonu 17.

Dosud existuje pouze jedna studie, která popsala ITD v exonu 12.

U koček je úloha mutací c-kit v mastocytomech poměrně nejasná, doposud byly nalezeny ITD v exonu 8.

Existuje mnoho důkazů, že mutace c-kit korelují se zvýšenou agresivitou nádorů. C-kit mutace jsou častější v II. a III. gradingu než v I. stupni, korelují s přítomností proliferačních markerů Ki67 a AgNOR, jsou častější u mastocytomů charakterizovaných buď recidivou, metastázami nebo úmrtím pacienta v souvislosti s tímto onkologickým onemocnění. C-kit mutace negativně korelují s uzdravením a přežitím, neboť akumulace somatických mutací pohání onkogenezi od pre-neoplastických lézí až po pokročilou vysoce metastatickou rakovinu.

Přístup k analýze c-kit mutací

Komplexní test celé sekvence c-kit genu je finančně i časově náročný. Přistoupilo se k rutinnímu testování hot spot úseků. Lze analyzovat cDNA získanou přepisem nádorové RNA, ale tento přístup s sebou nese technické problémy spojené s rychlou degradací RNA a ztrátou mutací sestřihových oblastí. Proto se rutinně přistoupilo k analýze genomové DNA. To umožnilo analyzovat i dlouhodobě uskladněné histologické vzorky a nasbírat velké množství dat. Navíc odpadá problém se stabilitou materiálu, náklady na RNase free prostředí a náklady na speciální přepravu.

Screening c-kit mutací je prováděn PCR, následovanou kapilární fragmentační analýzou (kvůli záchytu ITD, indel mutací, inzercí a delecí) a sekvenační analýzou (kvůli jednonukleotidovým subtitucím).

U biopsií nádorů mohou být mutované varianty c-kitu z různých důvodů řídce zastoupeny až podreprezentovány ve srovnání s normálními wild-type alelami. Samotný klinický vzorek je heterogenní a obsahuje mutované alely reaktivních buněk i wild-type alely normálních buněk obklopujících tumor, proto velmi záleží na odběru reprezentativního vzorku pro testování.

Bylo zjištěno, že schopnost PCR a pyrosekvence detekovat somatickou mutaci je přibližně 10 %. Tato hodnota může být zvýšena laserovou mikrodisekcí (LCM), kdy dojde k obohacení vzorku nádorových buněk. Nicméně technika LCM vyžaduje nákladné vybavení a nemusí být inherentně přesná. LCM může pomoci obohatit vzorek nádorových buněk, ale v těchto buňkách může vzácná mutovaná alela chybět nebo může být jen v extrémně malém množství.

Velmi efektivní a levný způsob, jak zvýšit signál mutovaných alel ve vzorku, přináší metoda COLD-PCR, která umožní přednostní amplifikaci mutovaných alel ze vzorků směsí normálních a nádorových buněk díky použití nižší denaturační teploty. Metoda COLD-PCR se opírá o následující pozorování: dva amplikony lišící se jedním nukleotidem mají rozdílné teploty tání (Tm) 0,2 až 1,5 ° C. Každá dvojvláknová DNA sekvence má kritickou denaturační teplotu (Tc), která je nižší než její Tm. Účinnost amplifikace PCR pro sekvenci DNA prudce klesá, pokud je denaturační teplota nastavena pod její Tc. DNA amplikony lišící se jediným nukleotidem reprodukovatelně mají různé amplifikační efekty, když je denaturační teplota PCR nastavena na Tc.

Shrnutí

ITD mutace c-kit v exonu 11 představují většinu somatických mutací v mastocytomech (asi 65 %). Asi 35 % známých mutací se vyskytuje jinde, a to v exonech 8, 9 a 17.

Náš molekulárně-genetický test "PCR vyšetření mutací c-kit" zahrnuje vedle PCR zaměřené na exon 11 také amplifikace klasickou PCR a COLD-PCR exonů 8 a 9, oboje s florescenčně značenými primery umožňujícími detekci dokonce jednobodových délkových změn fragmentů. Sekvenační analýza pro hledání jednobodových záměn je provedena na exonu 8 i 9.

Klíčové pro detekci somatických mutací c-kit je použití dostatečného množství nádorových buněk. Proto je vhodné na cytologických a histologických vzorcích označit místo, které má být na základě histopatologického vyšetření použito pro molekulárně-genetickou analýzu, tyto buňky pak budou zahrnuty do izolace genomové DNA.

Vzorky

  • biopsie (nativní nebo zmražená)
  • cytologie (barvená nebo nebarvená)
  • histologie (řezy montované na skle)

Vzorky zasílejte doporučeně poštou nebo svozem přes Messenger (zákaznické číslo 10945).

Vyhotovení výsledků za 2-4 týdny.

.

Reference:

Differentiating feline inflammatory bowel disease from alimentary lymphoma in duodenal endoscopic biopsies: S. Sabattini, E. Bottero, M. E. Turba, F. Vicchi, S. Bo and G. Bettini; Journal of Small Animal Practice (2016) 57, 396–401

Veterinary PCR Diagnostics: eISBN 978-1-60805-348-3, chapter 7: PCR and Veterinary Cancer Diagnostic: Fabio Gentilini, Maria E. Turba, Claudia Calzorali

Seznam ras

Obvyklá doba vyšetření: 21 pracovních dnů
Cena za 1 test: 158.00 $ bez DPH