Testování psů: Molekulární analýza klonality B a T lymfocytů

země EU
země mimo EU
Česká republika
Jste registrován jako plátce DPH v zemi EU jiné než v České republice?
CZK EUR USD
Obvyklá doba vyšetření: 21 pracovních dnů
Cena za 1 test: 145.00 $ bez DPH

Molekulární analýza klonality lymfocytů

Diagnostika lymfoproliferativních onemocnění je založena na využití klinických, cytologických, histologických a imunofenotypizačních metod a detekci známých chromozomálních přestaveb.  Jako další diagnostický přístup lze využít stanovení klonality lymfocytů. Strategie stanovení klonality je založena na skutečnosti, že nádorová populace je monoklonální, tedy vzniká expanzí jediné buňky, kdežto fyziologická populace lymfocytů je polyklonální. Je však nutno zdůraznit, že ačkoliv klonalita může být vodítkem k určení diagnózy, samotná k určení diagnózy nestačí, a proto musí být posuzována v celkovém klinickém kontextu.

Adaptivní imunita se uplatňuje v pozdější fázi infekce, kdy přítomnost molekul z patogenních mikroorganizmů, tj. antigenů, aktivuje přes specifické antigenní imunoreceptory (TCR, BCR) příslušné klony T lymfocytů a B lymfocytů (nebo T a B buněk). Antigenové receptory jsou složeny z receptorových řetězců, z nichž každý je kódovaný lokusem v odlišné oblasti chromozomu. Na rozdíl od jiných genů nemají geny antigenových receptorů lymfocytů konstantní nukleotidové sekvence. Každý antigenový receptor je vytvořen přeskupením několika menších genových segmentů, které tak vytvoří jedinečnou sekvenci. Existuje několik typů genových segmentů antigenových receptorů:

  • V (variable)
  • D (diversity)
  • J (joining)
  • C (constant)

Během genové přestavby je z mnohočlenných skupin segmentů původního genového komplexu náhodně vybráno z každé skupiny vždy po jednom segmentu a ty jsou pak spolu spojeny v pořadí V-D-J. Spojení je umožněno speciálními mezerníkovými sekvencemi na koncích jednotlivých segmentů. Vznikne tak komplementaritu určující oblast 3 (CDR3), která je unikátní pro každý klon lymfocytů a determinuje specificitu antigenového receptoru. K CDR3 je ještě připojen segment C. Přestavba je složitý proces s velkou možností kombinací, jejímž výsledkem jsou unikátní sekvence DNA a tím pádem obrovská biologická variabilita.

klonalita1

Molekulární analýza klonality vizualizuje rozmanitost antigenových receptorů. Analýza využívá amplifikace CDR3 polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a následnou elektroforetickou separací fragmentů. PCR využívá forward primer komplementární k segmentu V a reverse primer komplementární k oblasti J. Amplifikace proběhne úspěšně jen v přestavěných úsecích, kdy se segmenty V a J dostanou blízko sebe.

klonalita3

Při reaktivních procesech adaptivní imunity se tvoří lymfocyty různých buněk, neboli klony mnoha různých lymfocytů, které se liší délkou CDR3 - při PCR tak vznikají amplikony různých délek, tzv. polyklonální křivka.

V neoplastických procesech jsou lymfocyty odvozeny od jediné buňky a tudíž mají identické CDR3 - při PCR se pak tvoří amplikony stejné velikosti, tzv. klonální pík.

Existují dvě strategie pro identifikaci všech existujících přeskupení V a J segmentů. První je topologický přístup, kdy se sekvenuje celogenomová DNA a vyhledávají se úseky kódující jednotlivé segmenty. Zjistí se tak, kde na chromozomech jsou úseky lokalizovány, ale nezjistí se, v jakých frekvencích dochází k jejich přestavbě. Druhý je přístup "V/J usage", kdy se sekvenuje cDNA získaná přepisem exprimované mRNA. Zjistí se tak, které úseky vznikají, ale nezjistí se, kde leží. Znalost topologie je důležitá proto, aby používané primery pokryly  všechny segmenty. Znalost V/J usage umožní limitovat počet potřebných primerů, což zlepší výkonost PCR. Pro optimální návrh analýzy a interpretace výsledků testů klonality, je znalost topologie lokusů i V/J usage zásadní.

Volba vzorku

Test klonality se provádí z genomové DNA, kterou lze izolovat z řady matricí. Genomová DNA není náročná na podmínky přepravy a skladování. Jako vstupní materiál lze použít cytologické i histologické tkáně, biopsie i tělní tekutiny, barvení ani zmražení vzorkům neškodí. Vzorky tkání fixované formalínem nebo parafínem mají defragmentovanou DNA a nejsou pro analýzu ideální.

Je vhodné na vzorku tkání označit část, která má být na základě histopatologického vyšetření pro izolaci DNA použita. Obvykle se vylučují tkáňové komponenty, které obsahují velké množství normálních lymfocytů (např. lymfatické uzliny),  neboť signál normálních buněk může zakrýt signál z neoplastické populace. Také je běžné vyloučit tkáně, které neobsahují lymfocyty (např. ledviny), protože velké množství ne-lymfatické DNA sníží senzitivitu testu.

Selektivní DNA extrakce vícero buněčných částí zvyšuje pravděpodobnost detekce klonality, ale vyžaduje mikroskopické vyšetření vzorku. DNA by měla být extrahována z částí vzorku, které byly mikroskopicky zmapovány, aby bylo možné porovnat morfologické, imunofenotypizační a molekulární zjištění.

Výběr cíle

Teoreticky je nejvhodnější do testování klonality zahrnout všechny lokusy antigenových receptorů, které kódují B a T buňky. Nicméně, ve veterinární medicíně je vyšetření výrazně limitováno financemi. Proto je  zařazení imunofenotypizace před analýzu klonality nezbytné  pro optimální výběr cíle a také pro správnou interpretaci výsledků testu klonality.

U B buněk se analýza zaměřuje na lokus IGH (těžký řetězec receptorů B-lymfocytů), u T buněk se zaměřuje na TRG lokus.

Interpretace výsledků elektroforézy

PCR by měly probíhat minimálně v duplikátech, aby bylo možné odhalit pseudoklonalitu (vysoká senzitivita PCR může způsobit amplifikaci několika málo přeskupení, což může být chybně interpretováno jako klonální přeskupení).

Elektroforeogramy musí být interpretovány v kontextu klinických, morfologických a imunofeno-typizačních vyšetření. Elektroforeogramy jsou rozděleny do několika kategorií:

  • klonální
  • polyklonální
  • pseudoklonální
  • nespecifický výsledek

Duplikáty PCR reakcí pak pro jednotlivé kategorie vypadají následovně:

klonalita4

obr1: klonální -> neoplastický proces

obr2: polyklonální -> přirozený reaktivní proces

obr 3 a 4: pseudoklonální nebo nespecifický výsledek -> neinterpretovatelný výsledek, pravděpodobně nedostatečná DNA

Pro správnou interpretaci testu je nutné si uvědomit následující úskalí:

1. Neprokázání klonality za přítomnosti neoplasie - příčiny falešně negativních výsledků, kdy  je negativní klonalita v rozporu s klinickým, morfologickými anebo imunofenotypizačním vyšetřením.

(a) Nedostatečné pokrytí sekvencí primery. Prevencí je použití vysoce komplexních multiplexních primerů.

(b) Mutace v místě vazby primeru. U B buněk dochází běžně k somatickým hypermutacím, což má za následek zvýšení variability. Prevencí je použití vysoce komplexních multiplexních primerů s variabilním cílením na lokusy B buněk.

(c) Polyklonální pozadí. Většina lymfomů obsahuje určitý podíl ne-neoplastických lymfocytů, buď proto, že nádor vznikl v lymfatickém aparátu nebo se vyskytuje v zánětlivém prostředí. Pokud je podíl ne-neoplastických lymfocytů významný, může zastínit monoklonální signál.

(d) Chromozomální aberace. Chromozomální aberace, jako jsou například translokace, mohou eliminovat geny antigenových receptorů.

2. Detekce klonality v nepřítomnosti neoplasie (benigní klonální expanze).

Identifikace benigních klonů se nedá provést na základě profilu elektroforézy, ale vyžaduje současně klinické, morfologické a imunofenotypizační vyšetření.

(a) Klonální expanze v reakci na stimulaci antigenem. Po stimulaci antigenem je spuštěna normální imunitní odpověď - tvorba CDR3 s proměnlivou délkou, vedoucí k polyklonálnímu elektroforetickému profilu. V některých případech však mohou klony proliferovat neproporčně a objeví se výrazné vrcholy nad polyklonálním pozadím. U lidí byl tento jev dokumentován v reakci na infekci, léky nebo při autoimunitním onemocnění. Ve veterinární medicíně je zatím málo popsán.

(b) U lidí některé klony T buněk produkují minimálně diverzifikované CDR3, kdy tato přeskupení mohou napodobit klonální populaci v polyklonálním pozadí. Tento jev zatím nebyl u zvířat dobře popsán.

(c) Nespecifická amplifikace. Dojde k amplifikaci zcela jiného úseku genu. Jev nastává častěji u vzorků s nekvalitní nebo nedostatečnou DNA. Je-li podezření na nespecifickou amplifikaci, je vhodné opakovat analýzu na nových vzorcích.

3. V elektroforeogramu jsou píky nejasného významu. Například jeden nebo dva výrazné píky na pozadí polyklonální křivky mohou značit neoplastický proces na pozadí reaktivního procesu. Tyto situace jsou vždy komplikované na interpretaci a je lépe analýzu opakovat.

4. Pseudoklonální profily / žádný specifický produkt. Z analýzy nelze udělat žádný závěr. K selhání analýzy mohlo dojít z mnoha důvodů - špatný vstupní materiál (nekvalitní DNA nebo nízké množství DNA), inhibice PCR, somatické hypermutace lokusů B buněk... v těchto případech je vhodné opakovat analýzu z nových vzorků.

Vzorky

  • biopsie (nativní nebo zmražená)
  • cytologie (barvená nebo nebarvená)
  • histologie (řezy montované na skle)
  • krev v EDTA

Vzorky zasílejte doporučeně poštou nebo svozem přes Messenger (zákaznické číslo 10945).

Vyhotovení výsledků za 2-4 týdny.

.

Reference:

Obrázky byly převzaty z publikace: S. M. Keller, W. Vernau, and P. F. Moore: Clonality Testing in Veterinary Medicine: A Review With Diagnostic Guidelines; Veterinary Pathology; 2016, Vol. 53(4) 711-725

Differentiating feline inflammatory bowel disease from alimentary lymphoma in duodenal endoscopic biopsies: S. Sabattini, E. Bottero, M. E. Turba, F. Vicchi, S. Bo and G. Bettini; Journal of Small Animal Practice (2016) 57, 396–401

GeneScanning analysis of Ig/TCR gene rearrangements to detect clonality in canine lymphomas: Fabio Gentilini, Claudia Calzolari, Maria E. Turba, Giuliano Bettini, Paolo Famigli-Bergamini; VETIMM-7873; No of Pages 10

Reduced diversity of immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in chronic inflammatory gastrointestinal diseases in dogs: Daniela Olivero, Maria Elena Turba, Fabio Gentilini; VETIMM-8625; No. of Pages 9

Retrospective monitoring of minimal residual disease using hairpin-shaped clone specific primers in B-cell lymphoma affected dogs: Fabio Gentilini, Maria E. Turba, Monica Forni; Veterinary Immunology and Immunopathology 153 (2013) 279– 288

Veterinary PCR Diagnostics: eISBN 978-1-60805-348-3, chapter 7: PCR and Veterinary Cancer Diagnostic: Fabio Gentilini, Maria E. Turba, Claudia Calzorali

Seznam ras

Obvyklá doba vyšetření: 21 pracovních dnů
Cena za 1 test: 145.00 $ bez DPH